返回首页|加入收藏|联系我们

产品分类
您现在的位置:首页 > 产品展示 > 核酸相关试剂 > DNA相关 > F003FuseIn 克隆重组酶

FuseIn 克隆重组酶

简要描述:

FuseIn Enzyme 专门为把 PCR 产物快速,定向,有效的克隆到任何目标载体而设计。有效的避免了在克隆过程中遇到的合适内切酶的选择,磷酸化,补平,加 A,使用中间载体等等一系列复杂步骤。无需连接酶,只需要把目标载体线性化(平末端,粘性末端都可以),PCR 产物无需任何酶促处理,直接和目标载体混合,20 分钟一站式解决所有问题。无需蓝白班筛选,无需担心克隆方向,无须担心阳性克隆比率。

操作步骤:

A. PCR 引物设计及片段准备: 用该克隆重组酶克隆目的基因或者目标 DNA 片 段到制定的线性化载体,PCR 扩增的引物外侧 必须有 8-30 个碱基与线性载体外侧完全配 对。

注意: 可以采用任何聚合酶来得到PCR产物,但是,引 物和引物二聚体会对FuseIn 有一定的抑制作用。 如果 PCR 反应得到单一的目的条带,PCR 产物 可以用 PCR 纯化试剂盒回收;如果 PCR 产生很 多非特异性条带,应该用凝胶回收纯化目的条 带。

适用范围:

1. PCRcloning into any vector

2. Long PCR DNA (up to 12kb) cloning

3. Gene transfer one vector to another

4. High-throughput (HTP) PCRcloning

5. In vitro joing of DNA fragments

B. 线性化载体的制备

载体的完全线性化对于重组实验至关重要,没有 线性化的载体会产生非常高的背景。 线性化后的 载体需要过柱纯化或者凝胶回收纯化。

C. 克隆重组反应的建立

线性化载体 (100-200ng/ul) X ul PCR 产物(100-200ng/ul) Y ul 10* FuseIn buffer 2 ul FuseIn 酶 1 ul Deionized water M ul Total 20 ul

备注: 1)室温 20-40 min ,立即转化或者-20℃ 低温冻 存,后续转化。

2)环境温度不能超过 30℃,25℃为适反应温 度。

3)大片段可以适当延长反应时间或者增加酶 量,长反应时间不能超过 1 小时。

D. 转化

1. 新鲜制备的或-70℃下保存的 100ul 感受态细 胞,置于冰上,完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬 浮。

2. 加入 10-12ul 连接液,轻轻混匀,冰上放置 30 分钟。

3. 42℃水浴 90 秒,冰上放置 2 分钟。

4. 加 600ul SOC 培养基,37℃ 250rpm 振荡培养 1 小时。

5. 室温下 4000rpm 离心 5 分钟,用吸头吸掉 500ul 上清液,用剩余的培养基将细胞悬浮。

6. 将细菌均匀细致得涂布在 90mm 平板上。 注:细菌的用量依连接的效率及感受态细胞的感 受率而进行适当调整。

7. 平板在 37℃下正向放置 1 小时后以吸附过多的 液体,然后倒置培养过夜。

 

保存条件及有效期

运输条件:低温   储存条件: -20℃ 

 保质期: 1 年 

留言框

  • 产品:

  • 您的单位:

  • 您的姓名:

  • 联系电话:

  • 常用邮箱:

  • 省份:

  • 详细地址:

  • 补充说明:

  • 验证码:

    请输入计算结果(填写阿拉伯数字),如:三加四=7
 
QQ在线咨询